celltechnology MITCAP說明書

MitoCasp

同時雙參數測定：線粒體膜電位檢測和半胱天冬酶（poly，3 / 7,8,9,1）活性。

產品代碼：MITCAP

產品描述

主要優點

• 同時檢測線粒體膜電位和半胱天冬酶活性。
• 讀數 - 流式細胞儀，熒光板讀數器，熒光顯微鏡。
• 可靠：產生定量和定性結果。給出了強烈的積極信號。
• 該試劑盒可與其他抗體或染色劑一起使用。
• 易于使用：無需制備細胞裂解液或進行蛋白質印跡。
• 細胞滲透性試劑。

背景

半胱氨酸蛋白酶檢測

細胞凋亡是細胞自我殺的進化保守形式，其遵循專門的細胞過程。該過程的核心組成部分是一系列稱為半胱天冬酶的蛋白水解酶。這些酶參與一系列反應，這些反應是響應促細胞凋亡信號而觸發的，并導致蛋白質底物的裂解，導致細胞的解體（1）。

已經在從秀麗隱桿線蟲到人類的生物體中鑒定了半胱天冬酶。哺乳動物半胱天冬酶在細胞凋亡和炎癥中發揮不同的作用。在細胞凋亡中，半胱天冬酶負責導致細胞解體的蛋白水解切割（效應caspase），并參與上游調節事件（啟動子半胱天冬酶）。活性半胱天冬酶由兩個大的（~20kD）和兩個小的（~10kD）亞單元組成，形成兩個異二聚體，它們以四聚體（2-4）結合。與其他蛋白酶一樣，半胱天冬酶被合成為經歷蛋白水解成熟的前體，自催化或通過具有相似特異性的酶級聯進行（5）。

線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位的喪失是細胞凋亡的標志。線粒體通透性轉換是誘導細胞凋亡的重要步驟。在此過程中，線粒體膜上的電化學梯度崩潰。認為崩潰是通過二聚化的Bax或活化的Bid，Bak或Bad蛋白在線粒體中形成孔而發生的。這些促凋亡蛋白的活化伴隨著細胞色素c釋放到細胞質中（11-14）。

分析原則

Caspase（poly，3 / 7,8,9,1）和線粒體膜電位檢測 - MitoCasp

半胱天冬酶特異性識別4個氨基酸序列（在其底物上），其必然包括天冬氨酸殘基。該殘基是裂解反應的目標，其發生在天冬氨酸殘基的羰基末端（6）。可以通過免疫沉淀，使用半胱天冬酶特異性抗體的免疫印跡技術，或通過使用在半胱天冬酶切割后變為熒光的熒光底物來檢測半胱天冬酶。MitoCasp使用一種新方法來檢測活性caspase（7-9）。該方法基于羧基熒光素（FAM）標記的氟甲基酮（FMK） - 半胱天冬酶的肽抑制劑。這些抑制劑具有細胞滲透性和非細胞毒性。一旦進入細胞內，抑制劑就與活性半胱天冬酶（10）共價結合。

Cell Technology利用陽離子染料顯示線粒體膜電位（15-17）。陽離子染料是可透過細胞的，并且在紅色區域具有強熒光信號，并且表現出低的膜電位獨立（非特異性）結合和毒性。在健康細胞中，陽離子染料由線粒體與DeltaPsi（膜電位）成比例地累積。在大多數細胞系中，陽離子染料在線粒體中的積累導致更高的熒光強度。在凋亡細胞中，線粒體膜電位受損，陽離子染料不會在線粒體中積累，并且這些細胞表現出較低的熒光信號。結合使用這兩種試劑，可以同時分析Caspase活性和線粒體膜電位。

用Staurosporine刺激Jurkat細胞3小時（B）或DMSO（A）。然后根據方案用MitoCasp試劑盒染色細胞。然后將細胞洗滌兩次并通過流式細胞術分析：Ex：488nm Em：FL1和FL2。

套件內容和長期存儲