細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用

摘要： 講述細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分類(lèi),并分別介紹各種轉(zhuǎn)染方法的原理、應(yīng)用、特點(diǎn),及各種轉(zhuǎn)染方法的比較.       常規(guī) 轉(zhuǎn)染 技術(shù)可分為兩大類(lèi),一類(lèi)是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,一類(lèi)是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染.前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于 啟動(dòng)子 和其它調(diào)控元件的分析.一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴(lài)于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如 熒光蛋白 ,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè).后者也稱(chēng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體（episome）存在.盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記,如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因）,潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH）,胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系.

轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大,許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例,細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等.一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù),如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法, 脂質(zhì) 體法各有利弊,其主要原理及應(yīng)用特點(diǎn)如下：

轉(zhuǎn)染方法    原理   應(yīng)用   特點(diǎn)

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附 細(xì)胞膜 被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 不適用于原代細(xì)胞

操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差

有些細(xì)胞不適用

DEAE-右旋糖苷法

帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)  但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用   轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位,DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染  瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高,DNA和細(xì)胞用量大, 需根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件

病毒 介導(dǎo)法

通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等

逆轉(zhuǎn)錄病毒

特定宿主細(xì)胞 但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期   需考慮安全因素

腺病毒 通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染  特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

需考慮安全因素

陽(yáng)離子 脂質(zhì)體 法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞 適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清.轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類(lèi)型變化大

Biolistic顆粒傳遞法

將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達(dá) 瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 可用于：人的表皮細(xì)胞,纖維原細(xì)胞, 淋巴細(xì)胞 系以及原代細(xì)胞

顯微注射法

用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染  瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限

多用于工程改造或 轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物的胚胎細(xì)胞

各種轉(zhuǎn)染方法的比較：

除上述傳統(tǒng)方法外,近年來(lái)上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì) 細(xì)胞毒性 小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞.其中樹(shù)枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉(zhuǎn)染性能Z佳,但樹(shù)枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性,且其合成工藝復(fù)雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子,每相隔二個(gè)碳個(gè)原子,即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進(jìn)一步的改性后,其轉(zhuǎn)染性能好于樹(shù)枝狀聚合物,而且它的細(xì)胞毒性低.大量實(shí)驗(yàn)證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí),PEI經(jīng)常做為核心組成成分.

線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些,過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低,有利于細(xì)胞定位,因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些.但近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物,從而提高轉(zhuǎn)染效率,但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉(zhuǎn)染效率卻較高.

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的 納米顆粒 ,從而提高轉(zhuǎn)染效率,當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后,其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解,使交聯(lián)聚合物分解為無(wú)細(xì)胞毒性的小分子PEI,這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性,其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義.

線性PEI——一種高效的陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染效率更高，細(xì)胞毒性更低。線性PEI廣泛適用于常見(jiàn)細(xì)胞系，如：HEK-293、HEK293T、Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、HIH/3T3和sf9等，PEI即使在有血清存在的情況下仍然能夠高效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，其具有*的轉(zhuǎn)染效率，重組蛋白的高表達(dá)水平，且與含血清的培養(yǎng)基相兼容，低細(xì)胞毒性，PEI的另外一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是較其他轉(zhuǎn)染試劑使用成本極低。

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